За последние годы описаны не только многочисленные противовирусные защитные системы бактерий, но и пути противодействия вирусов этим системам. Авторы недавней работы, опубликованной в Nature, детально описали механизм действия бактериальной защитной системы PARIS. Кроме того, они выявили и охарактеризовали способ, с помощью которого вирусы могут уклоняться от действия PARIS — а именно, благодаря наличию собственных вариантов молекул тРНК. "Гонка вооружений" бактерий и архей и заражающих их вирусов идет много миллиардов лет и, похоже, вовсе не думает заканчиваться. Ученые постоянно описывают не только все новые и новые защитные системы прокариот, но и механизмы, которые позволяют вирусам нейтрализовать оборону. Международная команда исследователей недавно разгадала, как вирусы могут обходить защитную бактериальную систему, известную как PARIS. Результаты исследования опубликованы в Nature [2]. Гены, кодирующие компоненты защитных систем бактерий и архей, проявляют тенденцию к колокализации в геноме и, кроме того, нередко локализуются внутри мобильных элементов, в том числе профагов и вирусов-сателлитов. Компоненты системы PARIS (от Phage Anti-Restriction Induced System), в частности, были обнаружены в сателлитах фага P2, которые внедрились в геном E. coli. Основной принцип работы PARIS, фундаментально отличающий эту систему от тех же систем CRISPR, — обнаружение чужеродных белков, а не вирусных нуклеотидных последовательностей. Так, у кишечной палочки E. coli PARIS выявляет фаг T7 по белку Ocr, который подавляет две защитные системы — систему рестрикции-модификации и систему BREX [2]. Таким образом, PARIS можно считать "второй линией обороны" — системой, которая научилась специфически распознавать фагов, уже вооруженных анти-рестрикционными белками, — красивая иллюстрация концепции гонки вооружений. В состав системы PARIS входят два белка — AriA и AriB. AriA относится к группе ABC АТФаз, а функции AriB однозначно не были определены, хотя он содержит нуклеазный домен TOPRIM. Что интересно, такая архитектура крайне популярна среди бактерий, и ABC- и TOPRIM-домены встречаются еще в десятке других иммунных систем прокариот. Но как вообще устроен PARIS? Авторы исследования предположили, что AriA и AriB формируют комплекс — сенсор вирусной инфекции, и не ошиблись: совместная преципитация AriA и AriB и последующий анализ выделенного комплекса показали, что белки действительно образуют крупный олигомер массой 430 кДа. Для детального описания его структуры ученые воспользовались криоэлектронной микроскопией и показали, что в состав комплекса входит шесть молекул AriA и три субъединицы AriB (рис. 1) [2]. Рисунок 1. Гомодимер AriA, гомодимер AriB и общий вид комплекса. AriA собираются в димеры, которые затем тримеризуются, образуя что-то вроде трех лопастей пропеллера. Субъединицы AriB присоединяются к AriA рядом с сайтами связывания АТФ на AriA. Димер AriA устроен по типу "голова к хвосту", а AriB присоединяются к комплексу, связываясь с AriA прямо поверх области, где два мономера AriA взаимодействуют друг с другом. В этом же месте (на границе двух мономеров AriA) располагаются два нуклеотид-связывающих домена, в которых и происходит гидролиз АТФ. Было также показано, что взаимодействие между AriA и AriB критически необходимо для работы защитной системы: при нарушении этого взаимодействия PARIS перестает работать. [2] Из предыдущих исследований известно, что систему PARIS может активировать антирестрикционный белок Ocr фага T7, в результате чего бактериальная клетка либо погибает, либо переходит в покоящееся состояние. Но какой из компонентов PARIS взаимодействует с Ocr, ясно не было. Чтобы ответить на этот вопрос, авторы исследования одновременно экспрессировали в бактериальных клетках AriA, нефункциональную форму AriB с мутацией в активном центре и модифицированный Ocr, за который в случае его взаимодействия с другим белком можно "вытащить" весь белковый комплекс. Оказалось, что Ocr взаимодействует с гексамером AriA; при этом, как было показано далее, AriB покидает комплекс [2]. Если сенсором вирусных белков является AriA, то какова функция AriB? Было показано, что сам по себе AriB при экспрессии в отсутствие AriA противовирусную защиту не дает и проявляет лишь умеренную токсичность. Гораздо токсичнее димерная форма AriB, которая освобождается после того, как AriA узнал белок-триггер. Кроме того, мутации в AriA, делающие его неспособным к взаимодействию с AriB, сводят на нет и противовирусные свойства PARIS. Авторы работы заключают, что для функционирования AriB критически необходимо его первоначальное взаимодействие с AriA; это достаточно необычно и отличает PARIS от классических систем, работающих по принципу токсин-антитоксин [2]. Оставалось выяснить, как именно активированный AriB приводит к клеточной гибели. Подойти к этой проблеме удалось с неожиданной стороны: если посмотреть на клетки после активации PARIS в микроскоп, то обнаружится, что у них сильно компактизуется нуклеоид, а такой фенотип характерен для клеток, у которых остановлена трансляция [3]. Чтобы оценить, действительно ли при работе PARIS подавляется трансляция, ученые оценивали скорость синтеза белка по поглощению 3H-меченного метионина. При активной PARIS поглощение 3H-меченного метионина снижается, а поглощение 3H-меченного тимидина немного повышается. Эта картина в целом характерна для ингибирования трансляции: синтез белка останавливается, а гены рРНК транскрибируются. Авторы заключают, что действие PARIS in vivo обусловлено подавлением трансляции, но при этом у нуклеазного TOPRIM домена AriB может быть много мишеней: мРНК, рРНК или тРНК [2]. Противоборство бактерий и вирусов нельзя было бы назвать гонкой вооружений, если бы вирусы не изобретали всё новые и новые пути для противодействия бактериальным защитным системам: например, уже упоминавшийся Ocr направлен против систем рестрикции-модификации. Вот и фаг T5 обладает способностью противостоять PARIS. Авторы работы предположили, что тут замешаны собственные вирусные тРНК, которых у T5 целых 23. Для подтверждения своей гипотезы ученые проверяли делеционные мутанты T5 на чувствительность к PARIS. В то время как фаг с полноценным геномом устойчив к PARIS, был найден мутант с маленькой делецией в области генов тРНК, который приобретал чувствительность к PARIS. Тот фрагмент генома, который этот фаг утратил, исследователи разделили на три части, которые были вставлены в плазмиды и внедрены в бактериальные клетки с активной системой PARIS. Выяснилось, что возвращение делеционному мутанту гена лизиновой тРНК давало полную устойчивость к PARIS при условии ее повышенной экспрессии. Таким образом, именно лизиновая тРНК защищает фаг T5 от PARIS [2]. Однако у фага с делецией лизиновой тРНК оставалась еще много других генов тРНК, и нельзя было исключать их роль в борьбе с PARIS-опосредованным иммунитетом. Уже в ходе дальнейшей работы при помощи РНК-секвенирования авторы смогли установить, что PARIS атакует целую серию молекул тРНК (лизиновую, треониновую и аспарагиновую), и фаг Т5 вооружен полным набором собственных вариантов этих тРНК. Они помогают ему спасти клетку лишь для того, чтобы вскоре самому ее убить [4]. Эта работа впервые показала новую неожиданную функцию для молекул тРНК в качестве ингибиторов иммунного ответа и ответила на вопрос, зачем в принципе вирусы часто кодируют собственные гены тРНК. Оставалось напрямую показать, что нуклеазная функция AriB специфична к клеточной тРНК. Анализируя РНК, выделенную из клеток с активной PARIS и экспрессирующих лизиновую тРНК фага T5, ученые пришли к выводу, что AriB разрушает клеточные тРНК, а лизиновую тРНК фага не трогает. Дело в том, что AriB распознает антикодоновую шпильку в тРНК, а лизиновая тРНК фага несет в этой области мутации, которые делают невозможным ее распознавание AriB. Таким образом, мишени AriB у фага могут быть модифицированы, что обеспечивает ему защиту от PARIS [2]. Наконец, авторы исследования обратили внимание на разнообразие систем PARIS и их возможную связь с другими защитными системами, в основе которых лежит ABC-АТФаза. Первоначальный филогенетический анализ на основе последовательностей AriA и AriB позволил выделить 11 различных групп систем, причем в двух из них произошло слияние генов с образованием единого гена AriAB. Анализ аминокислотных позиций, ответственных за разные функции, показал, что системы PARIS консервативны по компонентам, задействованным в передаче сигнала, и эффекторным элементам. В то же время участки, необходимые для распознавания разных вирусных триггеров, в разных системах различаются [2].
— Возможно ли как-то сравнить эффективность разных защитных систем? — Конечно, есть достаточно очевидный способ — померить, насколько каждая система снижает способность фага к образованию бляшек на бактериальном газоне, что называется EOP ( Efficiency of Plating)-анализом. Однако нужно учитывать эволюционный контекст и наличие гонки вооружений. Мы в лаборатории проверяем конкретный вариант иммунной системы и конкретный штамм фага, в то время как в природе белки-триггеры и белки-сенсоры видоизменяются с огромной скоростью: стоит только фагу внести мутации в белок, который активирует иммунную систему, как он тут же захватит популяцию, и бактериям придется полагаться или на то, что удастся где-то "раздобыть" новую иммунную систему, или на вариант иммунной системы с мутацией в белке-сенсоре, который теперь сможет узнавать "убегающего" фага. Таким образом, эффективность иммунной системы — это параметр крайне непостоянный, что, видимо, и приводит к тому, что разнообразие различных иммунных систем настолько огромно: это самая разнообразная группа генов во всем "пангеноме" микроорганизмов. Стоит еще учитывать, что у медали есть две стороны, и если система окажется слишком эффективной, это приведет к развитию аутоиммунных заболеваний: она начнет срабатывать, даже если в клетке нет вируса. Так что работа иммунных систем требует крайне тонкой настройки. — Есть ли преобладание тех или иных систем в разных группах прокариот? Иными словами, бывает ли так, что представители какой-то группы прокариот почти всегда используют одну или несколько защитных систем? — Это область достаточно активных исследований, красиво было бы предполагать, что у разных бактерий разные вирусы, а значит, и разные иммунные системы, но на практике оказывается, что это не так. Некоторые иммунные системы распознают настолько фундаментальные особенности биологии вирусов, что распространены и в бактериях, и в археях, и даже у человека. Это одно из крайне важных открытий последних лет — многие системы врожденного иммунитета эукариот возникли когда-то в бактериальных островках защиты. Даже если проводить параллели с нашей работой, у человека есть белки-нуклеазы SAMD9 [5] и Schlafen [6], которые начинают расщеплять клеточную тРНК в ответ на заражение вирусом, а некоторые вирусы герпеса кодируют собственные тРНК, хотя их функция еще не показана. Бывают исключения, когда необычные микроорганизмы, такие как археи, экстремофильные бактерии или многоклеточные стрептомицеты начинают предпочитать какие-то конкретные иммунные системы, но, в целом, различные гены, связанные с противовирусным иммунитетом, равномерно перемешиваются не только между разными геномами, но и между разными системами. Такие гены крайне мобильны и сами переносятся вирусами, плазмидами и транспозонами; к тому же иммунные системы похожи на конструктор: можно менять части местами и постоянно получать новые рабочие варианты.
Рисунок 1. Гомодимер AriA, гомодимер AriB и общий вид комплекса. AriA собираются в димеры, которые затем тримеризуются, образуя что-то вроде трех лопастей пропеллера. Субъединицы AriB присоединяются к AriA рядом с сайтами связывания АТФ на AriA. Димер AriA устроен по типу "голова к хвосту", а AriB присоединяются к комплексу, связываясь с AriA прямо поверх области, где два мономера AriA взаимодействуют друг с другом. В этом же месте (на границе двух мономеров AriA) располагаются два нуклеотид-связывающих домена, в которых и происходит гидролиз АТФ. Было также показано, что взаимодействие между AriA и AriB критически необходимо для работы защитной системы: при нарушении этого взаимодействия PARIS перестает работать. [2]